La tradizione fa risalire la fondazione della basilica a Matilde di Westfalia (895-968), madre di Ottone I il Grande, la quale, in viaggio dalla Germania con l’intento di erigere a Roma un santuario dedicato al S. Sepolcro, fece sosta ad Acquapendente dove, spinta dagli eventi o da un sogno premonitore, ordinò di far costruire la chiesa.

Originariamente a forme romaniche, ha subito nel tempo diverse trasformazioni fino al secolo XVIII quando, in conformità con i canoni del barocco settecentesco, venne interamente ricostruita la facciata e sostanzialmente modificata la navata centrale. Il suo interno si sviluppa su tre livelli: il superiore del transetto con l’altare centrale e le cappelle di S. Ermete e del Sacramento; il mediano con le tre navate; l’inferiore con la cripta romanica del XII secolo. Anticamente l’interno della basilica era caratterizzato da due file di pilastri che differivano nella forma e nel numero (quattro a sinistra e tre a destra). Di questi pilastri rimangono sulla sinistra, a terra, le quattro basi di diversa fattura “a croce lobata”, “circolare” ed “esagonale” e sulla destra il primo dei pilastri di forma ottagonale a mattoni; il soffitto barocco a finta volta, crollato a causa dei bombardamenti della seconda guerra mondiale, è stato sostituito da capriate e da coperture lignee.

La cripta del S. Sepolcro costituisce, per il gioco di colonne ed archi e per la sua antica origine (metà del XII secolo), uno degli esempi più caratteristici ed importanti di cripte romaniche in Italia. Occupa lo spazio sottostante il transetto e l’abside della omonima cattedrale; le 24 colonne che la costituiscono suddividono la pianta in nove piccole navate, coperte da volte a crociera costolonate, che formano una caratteristica.

Le decorazioni dei capitelli sono dominate da figure zoomorfe che si alternano con grandi varietà di soggetti e forme tra le quali uccelli, composizioni vegetali, teste di ariete. Al centro della cripta, una doppia scalinata, scavata nella pietra, permette di raggiungere il sacello a forma di piramide rettangolare, riproducente il S. Sepolcro di Gerusalemme, con la presenza nel tabernacolo interno, di pietre incastonate che, secondo la tradizione, sarebbero state bagnate dal sangue di Cristo durante la Passione, come attesta una iscrizione latina posta nel muro davanti all’apertura del sacello.